| 孕激素对成骨细胞增殖和分化的影响 |
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来自:中国医疗设备网 时间:2005-8-9 |
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[摘要] 目的 观察孕酮和左炔诺孕酮对正常妇女成骨细胞和成骨肉瘤MG-63细胞增殖和分化的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝法，检测应用不同浓度孕酮及左炔诺孕酮刺激上述两种成骨细胞增殖的情况；并采用半定量RT-PCR及免疫组化法，测定c-fos、c-jun基因及其蛋白和骨钙素mRNA表达。结果 以浓度为0mol／L的孕酮和左炔诺孕酮为对照，10-10、10-8、10-6mol／L孕酮分别增加人成骨细胞及MG-63细胞增殖达9.8％、23.0％、32.8％及7.8％、15.6％、21.8％；10-10、10-8、10-6mol／L左炔诺孕酮分别增加人成骨细胞及MG-63细胞增殖达12.5％、21.9％、32.8％及9.6％、14.4％、23.0％；孕酮及左炔诺孕酮促进两种成骨细胞c-fos、c-jun基因及其蛋白的表达，表达呈剂量依赖性；10-10、10-8、10-6mol／L孕酮和左炔诺孕酮增加人成骨细胞骨钙素mRNA表达分别为12.2％、23.7％、45.5％及18.6％、32.1％、60.3％；孕酮和左炔诺孕酮对MG-63细胞骨钙素mRNA的表达无影响。结论 孕酮和左炔诺孕酮可刺激成骨细胞增殖，增加c-fos、c-jun基因及其蛋白的表达，促进骨钙素mRNA的表达。
[关键词] 孕酮；左炔诺孕酮；成骨细胞；基因，fos；基因，jun；骨钙素
近年来，孕激素在骨代谢调节及骨质疏松症发生、发展中的作用，日益受到重视。动物实验表明，在骨的生长发育中，孕激素可刺激骨形成[1]。c-fos、c-jun基因是与成骨细胞增殖、分化和成熟密切相关的原癌基因[2]。骨钙素则是成骨细胞分化的特异性表征。本研究应用孕酮和左炔诺孕酮干预正常妇女成骨细胞和人成骨肉瘤MC-63细胞株，观察孕激素对两种成骨细胞c-fos、c-jun基因及其蛋白和骨钙素mRNA表达的影响，探讨孕激素在绝经后骨质疏松症的发病的机制和激素补充治疗中的作用。
对象与方法
一、研究对象
选取2002年1月至2002年12月，在中南大学湘雅二医院骨科因外伤性骨折需手术治疗的女性患者6例，年龄31-49岁，即往健康，无肾病、糖尿病及骨代谢疾病史。术中取6例患者松质骨进行细胞增殖试验；取2例患者松质骨进行c-fos、c-jun及其蛋白检测；取2例患者松质骨进行骨钙素基因检测，松质骨获得的成骨细胞传代后分别应用孕酮及左炔诺孕酮进行干预。
二、方法
1．细胞培养及干预试验：(1)成骨细胞培养：手术取6例正常成年女性松质骨，剪成2mm3大小碎块，经磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗、摇荡3次，加入1mg／mlⅣ型胶原酶(美国Sigma公司产品)于37℃震荡消化。待松质骨变白并呈蜂窝状后，加入含20％胎牛血清(美国Gibco公司产品)的基本培养基(minimum essential medium，MEM)培养液(美国Sigma公司产品)中终止消化；采用含10％胎牛血清的MEM培养液洗涤3次，待洗涤液中不含细胞时，将骨片贴于25cm2培养瓶，加入含15％胎牛血清的MEM培养液，置人37℃，5％C02培养箱中培养；2d后换液1次，之后每3d换液1次，培养约15d后，可见细胞游出，约25 d后细胞融合；采用0.25％胰酶-乙二胺四乙酸(美国Sigma公司产品)消化，以5×105个细胞／瓶接种培养至25 cm2培养瓶。(2)MG-63细胞培养：将MG-63细胞株(第98代，美国培养物保存中心提供)置人含10％胎牛血清MEM培养液培养。每3 d换液1次，待细胞融合后采用0.25％胰酶-乙二胺四乙酸消化，按5×105个细胞／瓶接种至25cm2培养瓶。(3)人成骨细胞和MG-63细胞融合后，更换含有0.1％牛血清白蛋白的无血清MEM培养液(美国Sigma公司产品)培养24 h，分别采用浓度为10-10、10-8、10-6mol／L的孕酮(美国Sigma公司产品)和左炔诺孕酮(美国Sigma公司产品)进行干预，分别以含有0.1％牛血清白蛋白的MEM培养液作为对照(因左炔诺孕酮需用乙醇溶解，故左炔诺孕酮及其相对照的MEM培养液均含0.1％乙醇)。
2．细胞增殖试验：人成骨细胞和MG-63细胞以0.5×105／ml密度接种于96孔板，用含10％胎牛血清的MEM培养液培养24h后，换为含0.1％牛血清白蛋白的MEM培养液，第2天分别加入含上述不同浓度的孕酮和左炔诺孕酮培养液200 μl，继续培养24h(每个浓度设4个平行孔)，用四甲基偶氮唑蓝法测定成骨细胞增殖情况。
3．原癌基因c-fos、c-jun及骨钙素mRNA测定：采用半定量RT-PCR法，按试剂Trizol的操作说明抽提细胞总RNA，取2.0μg总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA。分别将c-fos、c-jun基因、骨钙素的引物和肌动蛋白引物放人同一PCR管中进行扩增，扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色显影并摄像。采用凝胶影像分析仪测定每个条带的吸光度(A)，计算目的基因与肌动蛋白基因的A比值。
4．c-fos、c-jun蛋白免疫组化染色：成骨细胞在装有盖玻片的6孔板培养24h，换为含0.1％牛血清白蛋白的MEM培养液，第2天分别加入上述不同浓度的孕酮和左炔诺孕酮，继续培养2h取出盖玻片，进行c-ofs、c-jun蛋白免疫组化染色。具体步骤为：采用4％的聚合甲醛固定盖玻片20min，常温下置于0.1％ Triton X l00试剂-PBS 20min，室温下置于3％H202**20min后，采用10％正常羊血清于室温下封闭30 min，吸去血清，滴加兔抗人c-fos、c-jun多克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品，稀释度均为1：30)，于4℃过夜。加生物素化羊抗兔抗体(北京中山生物技术有限公司产品，1：100稀释)，于37℃，放置40 min，加入辣根酶标记链霉卵白素(1：100稀释)，于37℃，放置40min，加入二氨基联苯胺-过氧化氢溶液，在镜下观察至显色不再增强为止，将盖玻片用自来水冲洗、双蒸水漂洗(以上各步骤间均用PBS漂洗5 min，共3次)，常规脱水、透明、树胶封片。对照组用替代一抗。
三、统计学方法
应用SPSSl0.0统计软件，组间资料比较采用方差分析，数据以X±s表示。
结果
一、孕酮及左炔诺孕酮对人成骨细胞和MG-63细胞增殖的作用
以浓度为0mol／L的孕酮和左炔诺孕酮作为对照，浓度为10-10、10-8、10-6mol／L孕酮及左炔诺孕酮均能促进细胞增殖。孕酮分别增加人成骨细胞及MG-63细胞增殖达9.8％；23.0％、32.8％及7.8％、15.6％、21.8％，左炔诺孕酮分别增加人成骨细胞及MG-63细胞增殖达12.5％、21.9％、32.8％及9.6％、14.4％、23.0％。两种孕激素对两种成骨细胞的增殖作用均呈剂量依赖性。两种孕激素对两种成骨细胞增殖作用比较，差异均无显著意义(P>0.05)。
二、孕酮及左炔诺孕酮对人成骨细胞和MG-63细胞中c-fos、c-jun mRNA及蛋白表达的作用
以浓度为0mol／L的孕酮及左炔诺孕酮作为对照，浓度为10-10、10-8、10-6mol／L的孕酮及左炔诺孕酮，均增加人成骨细胞和c-fos、c-jun mRNA的表达。孕酮增加人成骨细胞c-fos、c-jun mRNA的表达，分别为5.4％、15.3％、35.5％及7.2％、20.1％、40.3％，增加c-fos、c-jun mRNA的表达，分别为6.3％、17.3％、36.2％及9.5％、21.4％、42.2％。左炔诺孕酮增加人成骨细胞c-fos、c-jun mRNA的表达，分别为6.1％、23.6％、40.4％及8.2％、25.3％、42.6％，增力口MG-63细胞c-fos、c-jun mRNA的表达，分别为6.7％、24.2％、40.8％及9.6％、27.1％、45.5％。两种孕激素对两种成骨细胞c-fos、c-junmRNA的表达，均呈剂量依赖性。两种孕激素对两种成骨细胞c-fos、c-jun mRNA表达的比较，差别均无显著意义(P>0.05)。细胞免疫组化染色显示，人成骨细胞及MG-63细胞胞浆均染成黄褐色，并有散在黄褐色颗粒，表明细胞有c-Fos、c-Jun蛋白表达。经计算机图像分析细胞平均A值表明，孕酮和左炔诺孕酮c-Fos、c-Jun蛋白表达均增加。两种浓度为10-10、10-8、10-6mol／L的孕激素对人成骨细胞和MG-63细胞中c-Fos、c-Jun蛋白表达的作用，较浓度为0mol／L的孕激素的作用增加，两者比较，差异均无显著意义(P>0.05)。
三、孕酮及左炔诺孕酮对人成骨细胞和MG-63细胞骨钙素mRNA表达的作用
以浓度为0mol／L的孕酮及左炔诺孕酮作为对照，浓度为10-10、10-8、10-6mol／L的孕酮及左炔诺孕酮增加人成骨细胞骨钙素mRNA表达分别为12.2％、23.7％、45.5％及18.6％、32.1％、60.3％。两种孕激素对人成骨细胞骨钙素mRNA表达，均呈剂量依赖性。以10-8mol／L孕酮及左炔诺孕酮分别干预人成骨细胞24、48、72h，72h人成骨细胞骨钙素mRNA表达分别较24、48 h增加13.3％、22.3％及20.2％、30.5％，呈时间依赖性。将相同浓度和作用时间的孕酮及左炔诺孕酮对人成骨细胞骨钙素mRNA表达的作用进行比较，发现干预24h，左炔诺孕酮的作用是孕酮的1.2倍，48h前者是后者的1.4倍，72h前者是后者的1.5倍。两种孕激素对人成骨细胞骨钙素mRNA表达的作用比较，差异有极显著意义(P<0.01)。
但是，浓度为10-10、10-8、10-6mol／L孕酮及左炔诺孕酮对MG-63细胞骨钙素mRNA的表达无影响。以10-8mol／L的孕酮及左炔诺孕酮分别干预MG-63细胞24、48、72h，对MG-63细胞骨钙素mRNA表达也无影响。
讨论
体内外实验及转基因动物的研究发现，c-fos、c-jun基因的表达对骨重建具有重要意义。c-fos、c-jun基因在成骨细胞增殖期高表达，分化期低表达或无表达，与成骨细胞增殖激活有关。c-fos、c-jun基因编码的c-Fos、C-Jun蛋白参与形成转录因子AP-1复合物，AP-1复合物与成骨细胞的增殖分化及骨组织的形成和重建密切相关[2,3]。目前，有关孕激素诱导成骨细胞中c-fos、c-jun基因表达信号传递的机制报道较少。本研究结果发现，孕酮及左炔诺孕酮均能增加人成骨细胞和MG-63细胞c-fos、c-jun mRNA及其蛋白的表达，且随着药物浓度的增加，c-fos、c-jun mRNA及蛋白的表达增加，呈剂量依赖性。这与两种孕激素均能刺激两种成骨细胞增殖相一致，表明孕激素有可能通过增加c-fos、c-jun基因的表达，促进成骨细胞的增殖。
骨钙素由活跃的成熟成骨细胞合成和分泌，大部分沉积于骨基质，调节骨代谢。成熟的成骨细胞有骨钙素mRNA的表达，其蛋白产物是细胞增殖期后、矿化开始阶段大量分泌的非胶原蛋白。本研究结果表明，孕酮及左炔诺孕酮增加人成骨细胞骨钙素mRNA的表达，呈剂量依赖性，当浓度为10-6mol/L时，骨钙素mRNA表达增加最明显。同时两种孕激素对人成骨细胞骨钙素mRNA的表达呈时间依赖关系，作用72 h骨钙素mRNA表达增加明显。进一步比较了孕酮与左炔诺孕酮对人成骨细胞骨钙素mRNA的作用发现，左炔诺孕酮增加人成骨细胞骨钙素mRNA表达的作用更强，可能与左炔诺孕酮有一定的雄激素和雌激素样的作用有关。已有研究证实，左炔诺孕酮代谢产物能与雌激素受体发生作用[4]，上调雌激素受体的表达[5]。临床研究也表明，将左炔诺孕酮用于激素补充治疗，可提高患者骨钙素水平[6]。
本研究观察了孕酮及左炔诺孕酮对MG43细胞骨钙素mRNA的影响，结果提示，孕酮及左炔诺孕酮对MG43细胞骨钙素mRNA的表达无影响。不同的作用时间对MGm3细胞骨钙素mRNA的表达也无影响，可能由于骨钙素基因只有在基质矿化期开始后才被诱导表达，而成骨肉瘤MGm3细胞株代表的是分化早期阶段的成骨细胞，骨钙素基因在成骨细胞分化早期表达少，在基质矿化期表达才达到高峰。提示，MG43细胞株在基因表达和对药物、激素及生长因子的反应等方面，与人成骨细胞存在差异，在将该研究结果推广到人成骨细胞研究时，应慎重。
综上所述，孕酮及左炔诺孕酮能促进成骨细胞增殖和分化。绝经后孕激素水平明显下降，阻碍了成骨细胞增殖和分化，出现骨质疏松症。给予激素补充治疗，可减少骨丢失及增加骨形成。
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