| 荧光定量PCR技术 |
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来自:中国医疗设备网 时间:2005-6-3 |
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一 引言
核酸研究已有100多年的历史。本世纪60年代末70年代初，人们开始致力于研究基因的体外分离技术。197
1年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想: “经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程，便可克隆tRNA基因”。
PCR技术的发明人为Kary Mullis。他于1983年在一家生物高技术公司(Cetus)的人类遗传研究室工作。该研究室的主要任务是为公司的其他实验室合成寡核苷酸。当时有一种方法称为“DNA印迹法”，能够鉴定和比较DNA片段的长度，但是此方法步骤繁琐，时间周期长，还有放射性，Mullis很不喜欢这种方法。他着手用简单的方法鉴定DNA片段。经过一段时间的摸索，Mullis及同事于1985年成功地研制了PCR技术。此方法在分子生物科学家中也引起了链式反应。大家纷纷采用这个方法。在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛应用，被许多科学家视为近十年来，分子生物学领域最重要的一项技术突破。1993年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。
二 聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种在短时间内大量扩增特定DNA片段的核酸扩增方法。
在介绍PCR之前，我们先简单回顾一下DNA的复制。DNA是由四种碱基按互补配对原则(腺嘌呤A对胸腺嘧啶T，鸟嘌呤G对胞嘧啶C)组成的螺旋双链。在细胞内，DNA复制时，解螺旋酶首先解开双链，每个单链做各自模板，然后，另一种酶—RNA聚合酶合成一小段引物(Primer)结合到DNA模板上，DNA合成酶以这段引物为起点，合成与DNA模板配对的新链。
PCR技术即是在体外模拟DNA复制的过程，由变性—退火(复性)—延伸三个基本步骤构成:
假定研究的DNA双链两端的序列是:
TATACGGCCT………CTAGGCATAT
ATATGCCGGA………GATCCGTATA
在PCR之前，我们首先人工合成两段有20~30个碱基的引物，能够分别与上下链的一端配对，比如一条是atatg，另一条就是catat。把这两段引物和DNA模板、DNA聚合酶、底物(四种脱氧核苷)混合在一起，我们就可以开始PCR了(见图1)。
(1)变性: 把样品加热到93℃左右一定时间，让DNA模板变性变成单链。
(2)退火: 让样品的温度下降至55℃左右一段时间，引物就可以结合到模板上去。
TATACGGCCT………CTAGGCATAT
atatg catat
ATATGCCGGA………GATCCGTATA
(3)延伸: 让样品的温度上升到72℃左右一定时间，DNA聚合酶便可以从引物开始，用底物复制出新链。
这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过30个循环，就可以把原来的样品精确地扩增到230倍，只需2~3h。
三 荧光定量PCR(FQ-PCR)
自1989年开始，PCR技术被广泛应用于临床检验。它以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。但十多年的临床实践表明，传统的PCR技术本身还存在着一些问题，如产物污染导致的假阳性、不能准确定量等。为了解决上述问题，经国内外学者的不懈努力，众多PCR相关技术应运而生。其中最引人注目的便是荧光定量FQ-PCR技术。
1. 原理
荧光定量PCR最早是在1992年由日本科学家Higuchi报告提出的。FQ-PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，它在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物的变化，荧光信号变量和扩增产物变量成正比，并用足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析，最后通过标准曲线对未知模板进行分析，以达到对原始模板量定量的目的。它有几个主要的参数:
a. CT值
C代表Cycle，T代表Threshold，CT值的含义是: 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
b. 荧光域值(Threshold)的设定
将PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3~15个循环荧光信号标准差的10倍，即Threshold=10×SDcycle3~15。
c. 荧光化学
FQ-PCR所使用的荧光化学可分为两种: 荧光探针和荧光染料。
TaqMan荧光探针: PCR扩增时，在加入一对引物的同时，再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时，Taq酶的5’~3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
SYBR荧光染料: 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
2. FQ-PCR的特点
与普通PCR模式相比，FQ-PCR具备几个方面的优势:
a. 特异性
FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。
b. 敏感性
FQ-PCR的敏感度通常可检查出百万分之一的感染细胞，或10个病毒DNA分子，且线性范围很宽。进行定量检测时，其定量线性范围(5~6logs)比普通PCR(2~3logs)要宽得多。
c. 重复性
FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的CT值相同。因为阈值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。当PCR反应进入平台期后，由于反应体系各组分的耗尽，酶活性的降低，产物的反馈抑制等原因导致产物不再增加。
另外，FQ-FCR采用封闭的检测模式，并具备定性、定量、突变、多项目等检测功能，比普通PCR要先进。
四 荧光定量PCR在临床中的应用
由于FQ-PCR技术有传统PCR技术不能比拟的优势，因此它在临床上的应用越来越广泛。下面将简要阐述FQ-PCR在临床中的应用。
1. 早期诊断
在临床中，很多病毒的病原体在体内存在较长一段时间—“窗口期”后，机体才能产生抗体，这不利于对疾病的早期诊断; PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”。
对于乙肝、丙肝和艾滋病患者，目前临床上最常用的检测手段就是血清免疫学检测。人体在感染HBV、HCV、HIV等病毒的早期(急性期)，首先能在血清中检测到的是病毒核酸(DNA/RNA)，而相应的病毒抗原抗体常常会在这段“窗口期”无法检出。事实上，在该段时间内机体已经感染了病毒，而“两对半”、HCV抗体、HIV抗体检测却无法显示出阳性结果，但检测病毒核酸便可直接检查。因此，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA的检查对于该三种病毒感染的早期诊断，输血安全性的提高等都是十分有意义的。
2. 药物疗效观察
对病原体的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而难以及时地提供直接证据。而FQ-PCR检测可直接反映病原体滴度是否应药物治疗而发生变化，从而为药物疗效观察提供直接的依据。同时，药物治疗中可能引起的基因变异等情况，都依赖核酸检测提供的直接证据。
3. 肿瘤研究
尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因，这一点已得到普遍承认。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现。FQ-PCR不但能有效地检测基因的突变，而且能准确测定表达量，据此进行肿瘤早期诊断，治疗和预后判断。对某些癌基因的遗传学变化的检测几乎达到了确诊肿瘤的程度。
另外，FQ-PCR技术在分子遗传学，法医学，实验医学，甚至食品卫生行业都有很重要的影响。
五 展望
随着反应试剂、仪器和操作的不断发展和完善，以FQ-PCR技术为核心的检测试剂盒纷纷问世，并逐步趋向灵敏特异，快速精确和自动化。当然，由于其成本较高，操作难度大，目前在临床疾病的诊断和治疗上还未得到普及。
越来越多的研究者都趋向于将更多的精力投入FQ-PCR技术的研究开发，使之进一步合理化。提高检测方法的灵敏度，简化操作程序，消除非特异因素干扰都是研究的主要方向。目的是通过使FQ-PCR涉及的所有过程完全自动化，来提高临床检验结果的准确性。另外，FQ-PCR的分子灯塔技术与肽核酸技术结合，可大大增加反应的稳定性，届时将大大推动荧光定量检测技术在生命医学领域的应用。
毫无疑问，在不久的将来，FQ-PCR技术将以其显著的优势，在分子生物学、实验医学，特别是在临床医学领域中得到越来越广泛的应用。 |
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